Northern blots 技术 研究RNA的方法有很多种，常用的如核酸保护性分析(NPA)、RT-PCR、Northern blots等等。而Northern blots曾经是应用得最广的技术之一，尽管其分辨率和操作简易性都不如前者，但Northern blots依然是检测、定量mRNA大小及在组织中表达水平的标准方法，既是能直接提供有关RNA完整性、不同的剪接信息及mRNA大小等信息的唯一方法，也是在同一张膜上直接比较同一信息在不同样品中的表达丰度的首选方法。Northern blots的操作步骤相当繁琐，且对RNase污染非常敏感，任一步操作不当都会严重影响分辨率。尽管Northern blots曾经是应用得最广的技术之是，但不同的实验室甚至不同的人往往都会根据自己的条件采用不同的方法。通常我们称《分子克隆》所书的方法为标准方法（Maniatis）。然而优化这个标准方法中的以下几个操作步骤可以使其灵敏度提高10-20倍：探针的选择、膜的选择和转移方法、杂交液的选择、甲醛还是乙二醛的选择、试剂的质量。以下从这些方面分别加以讨论。 探针的选择 Northern blots探针的来源有多样性，可以是cDNA、PCR产物、寡核苷酸，也可以是RNA探针。由于双链探针中的反义链与RNA结合后，存在另一链的竞争性抑制，而RNA探针则不存在这个问题；另外RNA: RNA结合物热稳定性很高，RNA探针杂交要求更高的杂交温度(68度)和更严谨的洗膜条件，使背景降低；且合成RNA探针的DNA模版可以经DNase消化处理，不会干扰杂交，这些因素使得选用RNA探针比DNA探针的灵敏度提高10倍以上。同样理由，单链DNA探针又比Random Primed的双链探针要好。 膜的选择 由于硝酸纤维素膜通常不能耐受2轮以上的杂交和洗膜操作，而带正电的尼龙膜对RNA的结合力强且能从容耐受多轮杂交而信号并不减弱，处理大张膜时又不必担心撕裂或卷曲，因而成为首选。带正电的尼龙膜的唯一缺点是背景较高，特别是使用RNA探针时。现在膜类产品的专业生产厂家—德国S S公司推出的Nytran SuPerCharge尼龙膜带3倍重的正电荷，具有更大的结合容量，且表面经特殊处理使背景大大降低，能有效克服上述问题。 Nytran 尼龙膜 ·高亲和力 ·韧度强，既使反复杂交10次也不会损坏或撕裂 ·多用途：碱转膜、UV交联、克隆/噬菌斑杂交，等等 ·边角不卷曲，均匀杂交。既使湿润/干燥若干次，整张膜仍保持平整 ·结果清晰，易于获取目标分子 Nytran SuPerCharge高负荷正电尼龙膜----目前市场上所能提供的最好杂交膜 ·单位面积带有更多的正电荷，是普通正电尼龙膜带电量的3倍 ·克服了正电荷尼龙膜背景高的缺点，大大降低了背景和非特异性的结合 ·膜孔经、表面均一性、对称度和洁净度都非常的好，易于获取理想的实验效果 样品的选择 由于膜的载量有限，Northern blots的上样量因而受限，提高分辨率的方法之一是用mRNA代替总RNA电泳以提高mRNA的总量，而选用带更高电荷的尼龙膜得到更大的结合容量也有类似的作用。 转移方法 转移的方法有多种，真空转移因为快速高效而成为首选。没有条件做真空转移的可以选择毛细管转移或电转移。传统方法为上行毛细管转移，即吸水纸在胶、膜的上方，需4-18小时。Ambion公司推出的NorthernMax Kir提供了一种下行毛细管转移法，即吸水纸在胶、膜的下方，配合它的转移缓冲液可加快RNA，特别是大分子RNA的转移，使RNA转移得更完全，分辨率提高，且转移过程可缩短至１小时。 由于将核酸通过电转移到硝酸纤维素膜上要求很高的离子浓度，导致电流太大，需要大体积的缓冲液以保证缓冲容量不因电解而耗尽和大体积的冷却系统，因而这一方法较少使用。而核酸能在低离子强度下电转移固定在尼龙膜上，这也是尼龙膜优于硝酸纤维素膜的另一原因。 杂交液的选择 杂交液的选择直接影响信噪比、非特异性背景的高低。杂交液中应含有与探针匹配的阻断剂。许多杂交液只含有DNA阻断剂，当要做RNA探针杂交时必须加入变性的酵母总RNA或其它RNA阻断剂。另外杂交液应经过严格过滤以除去可能引致斑点背景的不溶物和小颗粒。当然它必须是无DNAse及RNAse的。 ULTRAhyb Solution含有DNA、RNA两种阻断剂，适用于各种探针；经严格过滤并保证无DNase、RNase的污染，无论同位素或非放杂交都能得到良好的信噪比。 传统的杂交需要16-24小时，一些商品化的快速杂交液（如Clontech，Ambion公司有提供）只须２小时即可完成，且不会丢失低丰度信息，特别值得一提的是它不会导致探针非特异地结合在核糖体RNA上，最大程度减少常规的杂交加速剂的背景问题，比标准方法分辨率提高至10倍。 甲醛vs.乙二醛？ 在含有甲醛的变性胶中进行RNA电泳是较常见的方法。相比之下，乙二醛／DMSO方法无须制备甲醛变性琼脂糖凝胶，无须通风橱等安全设备，只需将样品用乙二醛／DMSO预处理变性，在普通胶上电泳即可。但由于泳动速度慢而往往需要将电泳液循环以避免形成过高的氢离子梯度。 NorthernMax-Gly试剂盒经过改良，使RNA变性在上样buffer中一步完成，也无须将电泳液循环，上样量上限也从10ug提高到30ug。这两种方法的分辨率相当，但用乙二醛／DMSO方法对RNA进行分级分离时RNA条带会更为锐利。实际上选用哪种方法只是个人喜好而已。 试剂的质量 试剂质量对结果的影响不言而喻。Ambion公司提供以下2种完整的Northern杂交试剂盒，包含从琼脂糖、上样缓冲液、配胶缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液到杂交液、洗膜液，甚至除RNase的试剂在内的全套试剂（膜、Marker须另购），无须另配，省时省力。所有试剂均保证无DNAse、RNAse污染，均经过滤处理以减少斑点背景，配套试剂经优化以达到更高的分辨率（比标准方法高10倍以上）。适用于同位素标记或非放标记用。适用于各种RNA、DNA探针。 NorthernMax—Formaldehyde-Based Gels是常规的甲醛变性胶全套试剂盒, 加入快速杂交液，使杂交时间缩短为２小时。 NorthernMax-Gly—Glyoxal-Based Gels无须制备和在甲醛变性胶中电泳，只要将样品加入glyoxal/DMSO Loading Solution中加热数分钟即可完成变性过程并可以直接上样电泳。样品量可从10ug提高30ug，跑出的RNA条带（杂交结果）更为清晰（Sharp）。电泳时无须再循环缓冲液。可以在样品中加入EtBr以便观察电泳结果而不会影响分辨率（传统方法认为EB会与Glyoxal反应而不能预加EB）。配快速杂交液。